Nghiệm pháp Coombs (Coombs test)

Nghiệm pháp Coombs hay còn gọi là kỹ thuật kháng globulin (hay coombs test) là một thử nghiệm miễn dịch huyết học nhằm xác định hồng cầu c...

Nghiệm pháp Coombs hay còn gọi là kỹ thuật kháng globulin (hay coombs test) là một thử nghiệm miễn dịch huyết học nhằm xác định hồng cầu có gắn kháng thể (IgG) hay bổ thể hay không. Coombs được thử lần đầu tiên vào năm 1945 bởi các nhà miễn dịch học Cambridge Robin Coombs (được đặt tên cho test), Arthur Mourant và Rob Race

Trong một số bệnh hoặc điều kiện nhất định, máu của một người có thể chứa các kháng thể IgG có thể liên kết đặc biệt với kháng nguyên trên màng bề mặt hồng cầu, có thể dẫn đến hoạt hóa bổ thể và làm tan vỡ tế bào hồng cầu. Xét nghiệm Coombs trực tiếp được sử dụng để kiểm tra thiếu máu tan máu tự miễn dịch.

1. Kỹ thuật kháng globulin (Nghiệm pháp Coombs) dựa trên các nguyên lý sau:

+ Phân tử kháng thể và bổ thể là globulin.

+ Tiêm vào động vật globulin người sẽ kích thích động vật tạo ra kháng thể với globulin này (AHG: anti human globulin). Chất này được gọi là thuốc thử Coombs.

+ AHG sẽ phản ứng với phân tử globulin bám trên bề mặt hồng cầu hay tự do trong huyết thanh.

Nếu kết quả là kết tụ hồng cầu, nghiệm pháp Coombs trực tiếp là dương tính.

2. Có 2 phương pháp Coombs:

- Coombs trực tiếp DAT (Direct antiglobulin test): phát hiện kháng thể đã được cảm nhiễm trên bề mặt hồng cầu (tức là kháng thể đã được gắn lên bề mặt hồng cầu).

+ NP Coombs trực tiếp dùng để phát hiện hồng cầu đã có kháng thể hay bổ thể bám vào in vivo.

+ Một NP Coombs dương tính có thể không có biểu hiện tan máu miễn dịch.

+ NP Coombs dương tính không phải là chẩn đoán, vai trò của nó chỉ được đánh giá trong mối liên quan với tình trạng lâm sàng của bệnh nhân.

- Coombs gián tiếp IAT (Indirect antiglobulin test): phát hiện kháng thể không hoàn toàn lưu hành trong huyết thanh bệnh nhân. Nghiệm pháp Coombs gián tiếp phát hiện hồng cầu mẫn cảm (gắn kháng thể) in vitro, được sử dụng trong các trường hợp sau:

+ Phát hiện kháng thể không hoàn toàn (IgG) với hồng cầu người cho (phản ứng chéo) hay với hồng cầu mẫu (xét nghiệm phát hiện kháng thể bất thường).

+ Định danh kháng thể thông qua panel hồng cầu.

+ Xác định kiểu hình kháng nguyên (nhóm máu) của hồng cầu (Có nghĩa là lúc các bạn thử nhóm máu cũng là 1 Coombs test đó).

+ Làm hiệu giá với các kháng thể không hoàn toàn.

+ Sàng lọc phụ nữ có thai cho kháng thể có thể gây tán huyết sơ sinh.

3. Yếu tố ảnh hưởng đến nghiệm pháp Coombs:

- Nguyên tắc:

+ Mẫu bệnh phẩm phải được ly tâm tách huyết thanh ngay.

+ Thử nghiệm cần phải được làm trong vòng 2 giờ.

+ Mẫu bệnh phẩm trước khi tiến hành xét nghiệm phải được để ở 37°C, thời gian ủ từ 30-120 phút.

+ Tỷ lệ giữa huyết thanh và hồng cầu: Tăng tỷ lệ huyết thanh và hồng cầu sẽ tăng độ nhạy cảm. Tỷ lệ tối thiểu là 40:1

+ Kỹ thuật rửa hồng cầu: Sau lần rửa cuối cùng, phải loại bỏ hoàn toàn nước muối, vì phần nước muối còn lại sẽ pha loang dung dịch AHG và làm giảm độ nhạy của phản ứng.

+ Kỹ thuật thêm AHG:  AHG phải thêm vào hồng cầu ngay sau khi rửa xong để hạn chế tối đa kháng thể tách khỏi hồng cầu và trung hòa AHG.

+ Ly tâm: Tốc độ ly tâm thường là 500-1000 vòng trong 20 giây. Tốc độ ly tâm cao sẽ cho phản ứng nhạy hơn. Tuy nhiên phụ thuộc vào cách lắc có thể tạo ra phản ứng dương tính giả do lắc chưa đủ mạnh hay phản ứng âm tính giả do lắc quá mạnh. Cần xác định tốc độ quay và thời gian ly tâm đối với từng máy cụ thể để có kết quả tốt nhất.

- Nguyên nhân sai lệch kết quả:

+ Làm trái với nguyên tắc vừa nêu ở trên.

+ Tăng protein: bệnh nhân bị tăng protein tiềm tàng, tăng globulin bất thường – thuật ngữ là M protein, M spike hoặc paraprotein (điển hình là đa u tủy xương)…

+ Âm tính giả: Do thực hiện không đúng kỹ thuật. Rửa hồng cầu không đúng kỹ thuật là nguyên nhân chính gây âm tính giả do các kháng thể tự do còn lại sau khi rửa sẽ trung hòa AHG. Thuốc thử không đạt chuẩn, không được hiệu chuẩn…

+ Dương tính giả: Do thực hiện không đúng kỹ thuật hoặc hiện tượng đa ngưng kết.

+ Hiện tượng đa ngưng kết:

·         Trong huyết thanh Coombs có ngưng kết tố đa giá.

·         Sự gắn invivo của kháng thể đa giá (có hoặc không có vai trò của bổ thể) có các immunoglobulin trong huyết thanh Coombs.

·         Sự bất thường của màng tế bào: không hấp phụ theo cơ chế miễn dịch các protein huyết thanh.

·         Hiệu lực của tế bào sợi võng.

·         Các khó khăn để tinh khiết với Coombs bổ thể.

·         Sự có mặt của 2 quần thể hồng cầu.

·         Thử nghiệm Coombs trực tiếp với trẻ dưới 3 tháng tuổi: do ở đây có sự có mặt của kháng thể của mẹ lưu hành trong huyết thanh con, có thể là kháng thể đồng loài chống D, c, Fya, K, Jka.

4. Kết quả bất thường của Coombs trực tiếp nói lên điều gì?

Ngưng kết tụ (tế bào) của các tế bào máu trong xét nghiệm Coombs trực tiếp có nghĩa là bạn có kháng thể trên các tế bào máu đỏ và bạn có thể có một tình trạng gây ra sự phá hủy các tế bào máu đỏ bởi hệ thống miễn dịch của bạn, được gọi là tán huyết. Các bệnh thường gặp là:

+ Thiếu máu tan huyết tự miễn.

+ Phản ứng truyền máu.

+ Phản ứng giữa mẹ và trẻ sơ sinh do khác nhóm máu.

+ Bệnh bạch cầu lymphocytic mãn tính (CLL) và một số bệnh bạch cầu khác.

+ Lupus ban đỏ hệ thống.

+ Bệnh bạch cầu đơn nhân.

+ Nhiễm mycoplasma, bệnh giang mai.

Một số loại thuốc cũng khiến xuất hiện kháng thể với tế bào hồng cầu, bao gồm:

+ Các cephalosporin.

+ Levodopa.

+ Dapsone.

+ Nitrofurantoin.

+ Thuốc chống viêm không steroid NSAID như ibuprofen…

+ Quinidine , thuốc tim

Đôi khi, đặc biệt là ở người lớn tuổi, xét nghiệm Coombs sẽ có kết quả bất thường ngay cả khi không có bất kỳ bệnh hoặc yếu tố nguy cơ nào khác.

5. Thực hiện nghiệm pháp Coombs:

v  Coombs trực tiếp:

- Bệnh phẩm: bệnh phẩm máu đã được chống đông bằng EDTA, cùng giấy chỉ định làm nghiệm pháp Coombs trực tiếp.

- Dụng cụ, trang thiết bị: kính hiển vi, máy ly tâm có số vòng và thời gian chính xác, ống nghiệm sạch, pipet, khay đựng bệnh phẩm, giá cắm pipet, cốc mỏ…

- Sinh phẩm, hóa chất: huyết thanh Coombs, NaCl 0,9%, Hồng cầu chứng.

Tiến hành kỹ thuật:

- Ghi thông tin cần thiết của bệnh nhân lên ống nghiệm tiến hành Coombs trực tiếp.

- Rửa sạch hồng cầu bệnh nhân (đến khi soi trên KHV thấy hồng cầu rời rạc)

- Pha hồng cầu bệnh nhân 5%

- Nhỏ vào ống nghiệm đã chuẩn bị 1 giọt hồng cầu bệnh nhân 5% và 2 giọt huyết thanh Coombs → Lắc trộn nhẹ nhàng.

- Ly tâm chéo ở 1000 vòng/ 15 – 20 giây.

- Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.

+ Nếu kết quả (+) → tiến hành kiểm tra lại kỹ thuật hoặc trả kết quả Coombs (+)

+ Nếu kết quả (-) → nhỏ thêm 1 giọt hồng cầu chứng và ly tâm chéo. Nếu sau ly tâm chéo (+) từ 2+ → 3+ chứng tỏ Coombs trực tiếp (-). Nếu kết quả ly tâm chéo (-) thì phải tiến hành kiểm tra lại chất lượng của kỹ thuật và các dụng cụ, sinh phẩm hóa chất.

v  Nghiệm pháp Coombs gián tiếp:

- Bệnh phẩm: bệnh phẩm máu được lấy vào ống không có chất chống đông để tách lấy huyết thanh.

- Dụng cụ, trang thiết bị: kính hiển vi, máy ly tâm có số vòng và thời gian chính xác, ống nghiệm sạch, pipet, khay đựng bệnh phẩm, giá cắm pipet, cốc mỏ…

- Sinh phẩm, hóa chất: huyết thanh Coombs, NaCl 0,9%, hồng cầu cảm nhiễm, hồng cầu chứng, dung dịch Liss.

Tiến hành kỹ thuật

- Ghi thông tin cần thiết của bệnh nhân lên ống nghiệm thực hiện nghiệm pháp Coombs gián tiếp.

- Rửa hồng cầu cảm nhiễm O+ 3 lần bằng NaCl 0,9%.

- Pha hồng cầu cảm nhiễm O+ 5% bằng NaCl.

- Cho vào ống nghiệm đã chuẩn bị 1 giọt hồng cầu cảm nhiễm O+ và 2 giọt huyết thanh Coombs.

- Bịt paraphin, ủ trong bình cách thủy 30 phút hoặc ủ trong 15 phút nếu nhỏ thêm dung dich Liss.

- Sau đó tiến hành rửa 3 lần bằng NaCl.

- Nhỏ thêm 2 giọt huyết thanh Coombs → Lắc trộn nhẹ nhàng

- Ly tâm chéo ở điều kiện 1000 vòng / 15 – 20 giây.

- Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.

+ Nếu kết quả (+) → tiến hành kiểm tra lại kỹ thuật hoặc trả kết quả Coombs gián tiếp (+)

+ Nếu kết quả (-) → nhỏ thêm 1 giọt hồng cầu chứng và ly tâm chéo. Nếu sau ly tâm chéo (+) từ 2+ → 3+ chứng tỏ Coombs gián tiếp (-). Nếu kết quả ly tâm chéo (-) thì phải tiến hành kiểm tra lại chất lượng của kỹ thuật và các dụng cụ, sinh phẩm hóa chất.

Bài viết do cựu sinh viên ngành Xét nghiệm của trường ĐH Trà Vinh, hiện đang làm trong bệnh viện Xuyên Á, Củ Chi, TP.HCM.

Có tham khảo cách thực hiện nghiệm pháp Coombs của Diễn đàn xét nghiệm và bvdkquangnam. Cùng nhiều tài liệu tiếng Anh khác.